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研究蛋白質(zhì)糖基化的方法

點(diǎn)擊次數(shù)：15559 發(fā)布時間：2013/4/28 11:35:28

研究蛋白質(zhì)糖基化的兩種常用方法：

1. 以放射性單糖標(biāo)記細(xì)胞，使其被攝取后加在糖骨架上；

2.以特異性的化學(xué)試劑或酶裂解成分處理純化的多肽，去除部分或全部的糖基。

糖基化

在研究蛋白質(zhì)的糖基化時，使用特異性抗體通過免疫沉淀相應(yīng)的抗原是極為有用的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在SDS-PAGE中遷移時，首先要注意的就是糖基化。免疫沉淀下來的蛋白質(zhì)如果被糖基化，則計(jì)算出的分子質(zhì)量就比預(yù)計(jì)的大30％～50％，而且條帶會變寬。糖基化對細(xì)胞有多種作用，但主要是作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的特殊步驟中的標(biāo)記蛋白，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變可導(dǎo)致其活性改變�；蛱峁┘�(xì)胞外的結(jié)合區(qū)，從而對細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)及組織發(fā)育發(fā)揮作用。

特異性抗體有助于兩種過程的實(shí)施。

1. 在標(biāo)記的單糖發(fā)揮作用之后，將蛋白質(zhì)沉淀并通過SDS-PAGE分離，然后檢測其放射活性。摻有[³²S]標(biāo)記的蛋氨酸或其他氨基酸的蛋白質(zhì)可進(jìn)行免疫沉淀，然后以化學(xué)的或酶裂解成分處理或不加處理，通過SDS-PAGE分離后檢測活性的改變。

2. 活細(xì)胞用[³H]半乳糖或[³H]甘露糖進(jìn)行放射標(biāo)記，標(biāo)記時間應(yīng)較短，不超過1h，因?yàn)槎嗵强珊芸靺⑴c多種不同的生物合成途徑，含糖復(fù)合物以外的其他大分子中也可標(biāo)記。斷裂也是問題，因?yàn)闆]有簡單的方法可破壞所有的糖基化或全部的N端糖基化或O端糖基化。多肽—N糖基酶F常被用來裂解N端糖基，它可以斷裂大部分的N端糖基。其他常用的酶包括內(nèi)源性糖苷酶H和內(nèi)源性糖苷酶F。盡管從技術(shù)上講化學(xué)裂解較為復(fù)雜，但許多研究者認(rèn)為一旦在實(shí)驗(yàn)室建立該方法，便更可靠有效。*常用的化學(xué)裂解物是無水氟甲噻嗪。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司